Аналитичен процес
Анализ на митохондриална ДНК
Биологията на митохондриалната ДНК се различава фундаментално от нуклеарния геном. Майчино унаследяване, хетероплазмия с прагови ефекти, специфични за тъканта, липса на рекомбинация и хаплогрупова структура - всички тези особености променят начина, по който вариантите трябва да се класифицират. Част от ACMG критериите, проектирани за автозомна генетика, са неприложими, а останалите изискват специфични за мтДНК прагове и инструменти. Helena пренасочва митохондриалните варианти през специализиран класификатор, следващ спецификациите на MMDWG 2020.
MMDWG 2020 е авторитетният консенсусен документ на Експертната група на ClinGen за митохондриални заболявания. Преразглежда всичките 28 ACMG/AMP критерия за приложимост към мтДНК, изключва седем с дословна биологична обосновка и конкретизира четиринадесет със специфични за мтДНК прагове. Правилата за комбиниране от Richards 2015 се запазват непроменени. Helena предлага строго съответствие с MMDWG 2020, без специфични за платформата разширения към публикуваната спецификация.
Съдържание
Защо мтДНК се нуждае от собствена методология
Оценяването на митохондриален вариант с нуклеарен класификатор води до клинично некоректни резултати. MMDWG 2020 спецификациите съществуват именно защото биологията на мтДНК е достатъчно различна, че няколко ACMG критерия са неприложими, а други изискват специфични за мтДНК прагове.
Конкретен пример
Класическият MELAS вариант m.3243A>G има над хиляда публикувани случая, 4-звезден патогенен запис в ClinVar и е учебниковият вариант за митохондриална енцефаломиопатия. Обработен с нуклеарен ACMG класификатор без съобразяване с мтДНК, низът от критерии е празен, достоверността е нула, а присвояването е VUS. Обработен с MMDWG 2020 класификатора, същият вариант коректно получава приложимите критерии и е класифициран като патогенен с пълен одитен запис.
Разликата не е въпрос на предпочитание. Лаборатория или клинична платформа, която оценява мтДНК варианти с нуклеарен класификатор, произвежда грешни класификации. Helena пренасочва митохондриалните варианти през специализиран мтДНК класификатор, така че същият набор от данни, оценен от Helena, връща клинично коректни присвоявания за нуклеарни и митохондриални варианти.
Уникална митохондриална биология
Пет биологични особености разграничават мтДНК от нуклеарния геном и са залегнали в основата на MMDWG 2020 спецификациите.
Майчино унаследяване
Митохондриалната ДНК се наследява изключително по майчина линия. Няма бащин принос и няма автозомно-рецесивен модел. Поради това част от ACMG критериите, проектирани за автозомна генетика, са неприложими.
Хетероплазмия
Клетката съдържа много митохондрии, и всяка митохондрия съдържа много копия мтДНК. Патогенен вариант може да присъства на всяко ниво на хетероплазмия от няколко процента до хомоплазмия. Фенотипната проява често следва прагов ефект, специфичен за тъканта: вариантът може да е безсимптомен при ниска хетероплазмия и тежък при висока хетероплазмия в същия индивид.
Без сплайсинг, без рекомбинация
Гените на мтДНК не претърпяват сплайсинг, а геномът на мтДНК не претърпява хомоложна рекомбинация. Предсказването на сплайсинг е неприложимо. Вариантите се натрупват без изравняване чрез рекомбинация, което води до висока естествена вариабилност между хаплогрупите.
Хаплогрупова структура
Тъй като мтДНК не рекомбинира, вариантите се групират във фиксирани линии, наречени хаплогрупи. Някои варианти определят основни хаплогрупи и достигат висока алелна честота в своята линия, като отсъстват другаде. Патогенен вариант в една хаплогрупа може да е определящ доброкачествен вариант в друга, което изисква интерпретация, съобразена с хаплогрупата.
Прагов ефект
Фенотипът може да се прояви само когато вариант достигне конкретен праг на хетероплазмия в дадена тъкан. Под прага носителят е асимптоматичен; над него болестта се проявява. Това оформя клиничните доказателства: хетероплазмията на варианта корелира с тежестта на болестта в сегрегационни проучвания.
Пренасочване с двоен класификатор
Всеки вариант в сесията се пренасочва към нуклеарния или митохондриалния класификатор въз основа на хромозомен контекст и контекст на гена. Гранични случаи, включително пропуски в анотацията на D-loop и NUMT кандидати за псевдоген, се обработват изрично с информационни маркери, а не като критични грешки.
Митохондриален път
Кога: Митохондриална хромозома с митохондриален генен символ
Вариантът се пренасочва към MMDWG 2020 класификатора. Спецификациите на критериите са съобразени с мтДНК. Правилата за комбиниране от Richards 2015 се запазват непроменени. Изходът се етикетира с методология за мтДНК, така че последващите услуги и докладите го третират като такъв.
Нуклеарен път
Кога: Нуклеарна хромозома с не-митохондриален генен символ
Вариантът се пренасочва към стандартния ACMG 2015 класификатор. Непроменено. Огромната част от вариантите в типична WGS или WES сесия следват този път.
D-loop и пропуски в анотацията
Кога: Митохондриална хромозома, но без митохондриален генен символ, присвоен от предходна анотация
Пренасочва се към мтДНК класификатора с изричен маркер за анотация. мтДНК D-loop е регулаторен регион без белтък-кодиращи гени; някои анотационни процеси не присвояват генни символи към D-loop варианти. Класификаторът обработва този случай изрично.
NUMT кандидати за псевдоген
Кога: Нуклеарна хромозома с генен символ с митохондриален префикс
NUMT са нуклеарни копия на сегменти от митохондриална ДНК. Те са известна биологична реалност и призната причина за фалшиво положителни мтДНК извиквания. Вариантът се пренасочва към нуклеарния класификатор с изричен маркер за NUMT кандидат за псевдоген плюс допълнителни информационни маркери, когато са налични индикатори за ниска хетероплазмия, ниска дълбочина или известен регион, склонен към NUMT. Решението остава за генетика.
Критерии, прилагани към мтДНК
Двадесет ACMG/AMP критерия са приложими към мтДНК варианти според MMDWG 2020. Няколко имат специфични за мтДНК разлики в сила или прагове спрямо нуклеарния класификатор. Няколко изискват ръчно въвеждане на доказателства от генетика.
Много силно (Very Strong) доказателство за патогенност. За мтДНК, голяма хетероплазмична делеция, обхващаща поне един пълен ген, се третира като Very Strong. По-малки скъсявания в белтък-кодиращи гени следват дървото на решения Abou Tayoun, което произвежда Strong, Moderate или Supporting тежест в зависимост от въздействието върху транскрипта и скъсената фракция. Не е приложимо към единични нуклеотидни промени в тРНК или рРНК.
Силно (Strong). Същата нуклеотидна промяна като предишно установен патогенен вариант в белтък-кодиращ митохондриален ген. Ограничено до белтък-кодиращите гени в мтДНК.
Функционални проучвания. MMDWG 2020 ограничава PS3 до тежест на подкрепящо доказателство (Supporting) за мтДНК, поради липсата на стандартни параметри за обективен анализ на цибридни проучвания. Достъпно като заготовка за ръчни доказателства от генетика.
Разпространение на случаите в несвързани пробанди през разнообразни хаплогрупи от най-високо ниво. Заготовка за ръчни доказателства. Определението за засегнат пробанд следва MMDWG 2020 точно: класически митохондриални болестни синдроми или тревожни признаци според Haas 2007 и 2008.
Популационна честота под 1 на 50 000 от контроли в надеждни митохондриални бази. MMDWG 2020 специфицира Supporting тежест за този критерий в мтДНК, понижаване с една степен спрямо нуклеарното PM2 Moderate. gnomAD не съдържа мтДНК честоти; MITOMAP и HmtDB са основните честотни източници.
Инсерция или делеция със запазена рамка в неповтарящ се регион или загуба на стоп-кодон. Ограничено до белтък-кодиращите гени в мтДНК.
Различна промяна на същата позиция като известен патогенен вариант. Moderate тежест в белтък-кодиращи гени; Supporting тежест в тРНК и рРНК.
Предполагаемо de novo без потвърждение на майчинство чрез пълно мтДНК секвениране. Заготовка за ръчни доказателства.
Сегрегация в членове на майчиното семейство с корелация на хетероплазмия. Не може да се прилага, когато вариантът е хомоплазмен във всички членове на семейството. Заготовка за ръчни доказателства. Хетероплазмията трябва да сегрегира с тежестта на болестта.
In silico предиктори. Изборът на инструменти зависи от типа ген: APOGEE2 за белтък-кодиращи иРНК гени, MitoTIP и HmtVAR за тРНК гени. Несъгласувани предсказания не допринасят. рРНК in silico предсказване не се поддържа в момента.
Доказателства, специфични за фенотипа. За мтДНК изисква намалена ензимна активност на електронно-транспортната верига под 20 процента от средната стойност при контроли от лаборатория с CLIA одобрение в мускул, черен дроб или фибробласти. Заготовка за ръчни доказателства.
Самостоятелно доброкачествено доказателство. Честота на алела над 1 процент в митохондриални популационни бази, ИЛИ вариант, характерен за основна хаплогрупа, при индивид, чиято определена хаплогрупа съвпада. Условието за определящ хаплогрупата вариант е двойно: вариант може да е определящ маркер за хаплогрупа X, но патогенен в хаплогрупа Y за несвързано състояние. Засичането на конфликти предотвратява некоректно прилагане.
Силно доброкачествено доказателство. Честота на алела между 0,5 и 0,99 процента в митохондриални популационни бази. Стриктен диапазон, не отворен праг.
Heteroplasmy сравнение. Вариант, наблюдаван при по-високо heteroplasmy при здрав възрастен, отколкото в същата тъкан на засегнат индивид. Заготовка за ръчни доказателства.
Друг мтДНК вариант в същия индивид е независимо потвърден като патогенен. Симетрично: и двата варианта получават тази анотация взаимно.
In silico предиктори сочат към B (доброкачествен). Огледало на PP3 със същия избор на инструменти по тип ген.
Алтернативна молекулярна причина. Вариант, открит при индивид с потвърдена митохондриална болест, свързана с нуклеарна ДНК. Заготовка за ръчни доказателства.
Синонимен вариант в белтък-кодиращ мтДНК ген. MMDWG 2020 специфицира, че синонимни мтДНК варианти са подкрепящо доброкачествено доказателство, защото скрито нарушение на място за сплайсинг, което е обосновката за проверката за консервираност в нуклеарния BP7, не е приложимо за мтДНК.
Функционални проучвания, показващи липса на ефект. Заготовка за ръчни доказателства.
Липса на сегрегация при засегнати членове на семейството или бащина сегрегация. Бащината сегрегация сама по себе си изключва мтДНК патогенен вариант. Заготовка за ръчни доказателства.
Критерии, изрично изключени
Седем ACMG критерия са изключени за мтДНК според MMDWG 2020. Всяко изключване има биологична обосновка, публикувана дословно в спецификацията. Helena запазва тези изключения стриктно.
Информацията за консервираност, домейн и структура е вградена в in silico предикторите, използвани в PP3 (APOGEE2, MitoTIP, HmtVAR). Включването на PM1 отделно би отчело двойно същите доказателства.
Съставната хетерозиготност и рецесивно унаследяване не се прилагат към мтДНК. Геномът се наследява по майчина линия като единична хаплоидна единица.
Ниска честота на доброкачествени варианти с променен смисъл (missense) в гена от интерес не се прилага към мтДНК. Високата вариабилност между хаплогрупите е добре документирана; мтДНК толерира високи честоти на варианти с променен смисъл, защото не рекомбинира и има относително висока мутационна честота без хистонова защита.
Указания на ClinGen SVI: всеки вариант, наблюдаван в база данни, трябва да се оценява чрез базовите доказателства, а не да се разчита на самото твърдение. Това е обща SVI политика, прилагана към нуклеарния и митохондриалния път.
Повечето варианти в белтък-кодиращите мтДНК гени са с променен смисъл (missense), не скъсяващи. Предпоставката, че варианти с променен смисъл в ген, в който загубата на функция е основният механизъм, са вероятно доброкачествени, не е валидна.
Инсерции/делеции със запазена рамка в повторяеми региони на мтДНК са концентрирани в два добре известни хипервариабилни региона и рутинно се изключват от клинична интерпретация преди класификация.
Същата обосновка като PP5: твърденията в бази данни не трябва да се приемат без базови доказателства според политиката на ClinGen SVI.
PVS1 за мтДНК варианти
PVS1 е най-силният единичен критерий в ACMG методологията. За мтДНК MMDWG 2020 определя три пътя на прилагане, отразяващи биологичните разлики между големите делеционни синдроми, скъсявания в белтък-кодиращи гени и тРНК или рРНК варианти.
Път 1, голяма делеция (Very Strong)
Хетероплазмична мтДНК делеция, която обхваща поне един пълен митохондриален ген, получава PVS1 с Very Strong тежест. Това клинично съответства на синдроми с единична голяма мтДНК делеция, включително KSS, Pearson и CPEO. Критерият за установяване е функционален - обхващане на пълен ген, а не праг в базови двойки.
Път 2, белтък-кодираща скъсяваща последица (дърво на решения на Abou Tayoun)
Променящи рамката (frameshift), безсмислени (nonsense) и малки делеции в белтък-кодиращи мтДНК гени следват дървото на решения на Abou Tayoun 2018 за PVS1. Nonsense-mediated decay (разграждане на иРНК с преждевременен стоп-кодон) не настъпва за мтДНК, така че скъсената фракция на белтъка определя присвоената тежест. Варианти, оставящи повече от деветдесет процента от кодиращия регион непокътнати, обикновено получават PVS1 с Moderate тежест.
Път 3, тРНК и рРНК
Еднонуклеотидни варианти в тРНК или рРНК гени не са допустими за PVS1, освен ако не са част от делеция, обхващаща пълен ген, както в Път 1. MMDWG 2020 е категоричен, че с изключение на големи делеции, този критерий не може да се прилага към тРНК или рРНК варианти.
In silico предиктори по тип ген
MMDWG 2020 определя различни набори предиктори за различни типове мтДНК гени. Инструменти, оптимизирани за нуклеарни белтък-кодиращи варианти, не са приложими към митохондриални тРНК структури.
Белтък-кодиращи (иРНК)
APOGEE2 е препоръчителният предиктор. Патогенно предсказание подкрепя PP3; неутрално предсказание подкрепя BP4. Несъгласувани предсказания от комбинираните предиктори не допринасят.
Транспортна РНК (тРНК)
MitoTIP и HmtVAR се оценяват съвместно. Съгласувано патогенно предсказание от двата инструмента подкрепя PP3. Съгласувано доброкачествено (B) предсказание подкрепя BP4. Несъгласувани предсказания не допринасят.
Рибозомна РНК (рРНК)
Няма стандартизирани in silico предиктори за рРНК в текуща употреба. PP3 и BP4 не се оценяват за рРНК варианти в тази методология. Бъдещи предиктори, базирани на вторична структура на рРНК, могат да бъдат включени с напредъка на областта.
Честота, съобразена с хаплогрупата
Тъй като мтДНК не рекомбинира, алелната честота, агрегирана глобално, може да маскира специфични за хаплогрупата модели. Вариант може да достигне висока честота в една хаплогрупа, докато остане отсъстващ в други. Класификаторът обработва това изрично.
BA1 самостоятелен доброкачествен критерий - две условия
BA1 се прилага, когато глобалната алелна честота надхвърля един процент в митохондриални популационни бази. Прилага се също, когато вариантът е определящ маркер за основна хаплогрупа и предсказаната хаплогрупа на пациента съвпада. И двата пътя се проследяват в следата от доказателства.
Засичане на конфликти
Вариант, определящ хаплогрупа X, може да е патогенен, когато се появи извън тази линия. MMDWG 2020 изрично отбелязва, че BA1 не трябва да се прилага, когато има противоречиви доказателства за патогенност в различен хаплогрупен контекст. Класификаторът проверява това и извежда предупреждение за конфликт между хаплогрупи към генетика.
Източници на честота
MITOMAP и HmtDB са основните мтДНК популационни честотни бази според MMDWG 2020. gnomAD не предоставя мтДНК честоти. PM2 подкрепящо доказателство изисква честота под едно на петдесет хиляди, BS1 силно доброкачествено изисква стриктния диапазон от 0,5 до 0,99 процента, а BA1 самостоятелно доброкачествено изисква над един процент.
Заготовки за ръчни доказателства
Няколко MMDWG 2020 критерия изискват доказателства, които не се извличат директно от анотацията на варианта. Примерите включват функционални проучвания, сегрегация в членове на майчиното семейство, ензимна активност на ETC и потвърдено майчинство чрез пълно мтДНК секвениране. Класификаторът ги предоставя като заготовки за ръчно въвеждане от генетика.
Заготовките включват PS3 (функционални проучвания, ограничени до Supporting тежест), PS4 (разпространение на случаите с разнообразие на хаплогрупите), PM6 (предполагаемо de novo без потвърждение), PP1 (сегрегация с корелация на хетероплазмия), PP4 (специфичен за фенотипа ETC дефицит в лабораторно тестване с CLIA одобрение), BS2 (сравнение на хетероплазмия между здрави и засегнати членове на семейството), BS3 (функционални проучвания, показващи липса на ефект), BS4 (липса на сегрегация или бащина сегрегация) и BP5 (алтернативна молекулярна причина от нуклеарна ДНК).
Анотациите от генетика се записват заедно с автоматизираните критерии с времеви печат и самоличност на потребителя. Повторното пускане на класификатора запазва ръчните анотации и преоценява само автоматизираните критерии.
Входни и изходни данни
Какво получава услугата от предходните етапи и от генетика, и какво произвежда за преглед.
От предходните етапи
Предварително анотирани варианти от предходния анализ на варианти
Генен символ за всеки вариант, последица, контекст на транскрипта и популационна честота
Оценки на in silico предиктори, когато са приложими към типа ген
ClinVar контекст и ниво на преглед, когато са налични
Хетероплазмия и дълбочина на четене, когато присъстват в изходния VCF
Входове от генетика
Ръчни анотации с доказателства за критерии, изискващи външни данни: PS3, PS4, PM6, PP1, PP4, BS2, BS3, BS4, BP5
Незадължителен контекст за хипотеза за наследяване (спорадично, наследено по майчина линия, неизвестно)
Незадължително обозначение на хаплогрупата, когато е установено чрез външно тестване
Резултати за генетика
Присвояване на ACMG клас: P (патогенен), LP (вероятно патогенен), VUS, LB (вероятно доброкачествен) или B (доброкачествен)
Низ от приложените критерии с изричен етикет на методологията, разграничаващ мтДНК от нуклеарни класификации
Следа от доказателства за всеки критерий, включително точки от данни, задействали критерия
Оценка за достоверност, отразяваща силата и съгласуваността на доказателствата
Маркери за NUMT кандидат за псевдоген, когато са приложими, за варианти на нуклеарни хромозоми с генни символи с митохондриален префикс
Предупреждения за конфликт между хаплогрупи, когато вариант е определящ за хаплогрупа в една линия, но се появява в различна линия
Стандарти и граници
Класификаторът работи спрямо публикувани стандарти и в рамките на ясни клинични граници.
MMDWG 2020 (McCormick et al.)
Пълната класификационна методология за варианти в митохондриална ДНК. Произведена от Експертната група на ClinGen за митохондриални заболявания и Консорциума за секвенирани данни при митохондриални заболявания (Mitochondrial Disease Sequence Data Resource Consortium) с осемнадесет съавтори от водещи клинични и академични центрове. Одобрена от ClinGen SVI и Надзорния комитет на работните групи по клиничните домейни (Clinical Domain Working Group Oversight Committee).
Препратка: McCormick et al., Hum Mutat. 2020;41(12):2028-2057, PMID: 33058415
ACMG/AMP 2015
Оригиналната ACMG/AMP класификационна методология. MMDWG 2020 запазва правилата за комбиниране от Richards 2015 непроменени и определя кои от оригиналните 28 критерия се прилагат към мтДНК, кои са изключени с дословна обосновка и кои изискват специфични за мтДНК прагове.
Препратка: Richards et al., Genetics in Medicine, 2015, PMID: 25741868
Abou Tayoun 2018 (PVS1)
Дърво на решения за PVS1 прилагане към скъсяващи варианти. MMDWG 2020 препраща към това за белтък-кодиращи мтДНК варианти, променящи рамката (frameshift), безсмислени (nonsense) и малки делеции. Използвано непроменено за белтък-кодиращия път.
Препратка: Abou Tayoun et al., Hum Mutat. 2018, PMID: 30192042 (дърво на решения за PVS1)
APOGEE2
In silico предиктор за патогенност за митохондриални белтък-кодиращи варианти, използван според PP3 спецификацията на MMDWG 2020.
Препратка: Castellana et al., MitImpact / APOGEE2 (in silico предиктор за патогенност на мтДНК)
MitoTIP и HmtVAR
In silico предиктори за патогенност за митохондриални тРНК варианти, използвани според PP3 спецификацията на MMDWG 2020 с изисквания за съгласуваност.
Препратка: Sonney et al., PLoS Comput Biol. 2017, PMID: 28732077 (MitoTIP за тРНК варианти)
MITOMAP и HmtDB
Основни митохондриални популационни честотни бази. MMDWG 2020 спецификацията изрично ги идентифицира като надеждни източници за алелна честота в мтДНК. gnomAD не се използва за мтДНК честота.
Граница на обхвата
Helena мтДНК анализът е за първична митохондриална болест, в точно съответствие с обхвата на MMDWG 2020. Методологията не е проектирана и не се използва за соматични онкологични мтДНК варианти, проучвания за дълголетие или контексти на предразположеност към комплексни заболявания.
Граници на докладването
Услугата произвежда класификация, приложени критерии и доказателствени изходи. Не генерира клинични интерпретации, не взима диагностични решения и не замества клиничния преглед. Целият изход е предназначен за преглед от квалифициран клиничен генетик преди всяко клинично действие.
Местоположение на данните
Услугата работи в рамките на платформата Helena върху инфраструктура в ЕС, съвместима с GDPR Член 9 и техническите изисквания на 1+MG.
Какво я отличава
Осем проектни решения, които правят Helena мтДНК анализа различен от стандартни ACMG класификатори, механично приложени към митохондриални варианти.
Специализиран мтДНК класификатор
Митохондриалните варианти се пренасочват към отделна класификационна система, която следва MMDWG 2020 спецификациите. Не се обработват с нуклеарен ACMG класификатор и неприложимите му критерии.
BA1, съобразен с хаплогрупата
Вариант, определящ една хаплогрупа, може да причини болест в друга линия. Класификаторът проверява и глобалната честота, и определящия за хаплогрупата статус спрямо предсказаната хаплогрупа на пациента, и засича конфликти, при които същият вариант има двойни доказателства.
Хетероплазмия в работния процес
Хетероплазмията се улавя за всеки вариант, където присъства в изходните данни, и се представя на генетика заедно с класификацията. Доказателството за сегрегация (PP1) изисква корелация на хетероплазмията с тежестта на болестта.
Отчитане на NUMT
Нуклеарните копия на сегменти от митохондриална ДНК са известна причина за фалшиво положителни мтДНК извиквания. Класификаторът засича варианти на нуклеарни хромозоми с генни символи с митохондриален префикс и извежда маркери за NUMT кандидат с индикатори за ниска хетероплазмия, ниска дълбочина и известен регион.
Предиктори, специфични за типа ген
APOGEE2 за белтък-кодиращи иРНК гени. MitoTIP и HmtVAR за тРНК гени. In silico предикция за рРНК изрично не се поддържа, съответствайки на обхвата на MMDWG 2020.
Дословна обосновка за изключване
Седем ACMG критерия са изключени за мтДНК. Всяко изключване носи обосновката от MMDWG 2020 дословно, запазена в системната документация и изложена в раздела за стандарти. Генетикът вижда защо даден критерий не се е приложил.
Без специфични за Helena разширения
Класификаторът предлага строго съответствие с MMDWG 2020. Правилата за комбиниране от Richards 2015 се запазват непроменени. Без специфични за платформата прагове, без нови комбинации на критерии, без неформални правила, наслоени върху публикуваната спецификация.
Ръчни доказателства с одитен запис
Критерии, изискващи външни данни (функционални проучвания, сегрегация, ензимна активност на електронно-транспортната верига, алтернативна молекулярна причина), се излагат като заготовки за ръчни доказателства. Анотациите от генетика се записват с времеви печат и идентификатор на потребителя за одит.
Вижте мтДНК анализ в действие
Заявете демонстрация, за да видите как Helena класифицира реален митохондриален набор от данни спрямо методологията MMDWG 2020 - с пълна проследимост на критериите, съобразяване с хаплогрупата и откриване на NUMT, видими за всеки вариант.