Методология за мтДНК
Пълна документация на това как Helena класифицира варианти в митохондриалната ДНК съгласно спецификацията на ClinGen Mitochondrial Disease Working Group (MMDWG) 2020 (McCormick EM et al., Hum Mutat. 2020;41(12):2028-2057. PMID: 33058415. DOI: 10.1002/humu.24107). Всеки праг, доказателствен източник и степен на ръчна оценка, използвани в работна среда, са документирани на тази страница. Тази документация е предназначена за клинични генетици, ръководители на лаборатории и одитори по акредитация.
Вариантите в мтДНК се класифицират съгласно MMDWG 2020 (McCormick), а нуклеарните варианти - съгласно ACMG/AMP 2015 (Richards). Двете методологии работят като независими модули; всеки вариант в изхода носи изричен етикет за това коя методология е произвела класификацията. Степените на сила следват конвенциите на ClinGen mtDNA VCEP v1.0.0. Правилата за комбиниране запазват осемнадесетте правила на Richards 2015 непроменени, съгласно McCormick Раздел 5.2.
Съдържание
Преглед на процеса
Седемстепенен процес за класификация на мтДНК. Вариантите в мтДНК се насочват към методологията MMDWG, анотират се срещу подбран митохондриален референтен набор, оценяват се срещу единадесетте автоматизирани критерия, интегрират се с доказателства от ръчна оценка, подадени от генетика, и се решават чрез правилата за комбиниране на Richards 2015 със специфични за мтДНК замествания.
Идентификация на варианти в мтДНК
Вариантите, разположени на митохондриалната хромозома, се идентифицират при зареждане на файла. Приемат се шест стандартни означения за мтДНК хромозома (chrM, M, MT, chrMT, NC_012920.1, J01415.2) и се привеждат към единен референтен идентификатор. Кандидати за нуклеарни псевдогени (NUMT области, познати от публикувани каталози) се маркират за видимост, без да блокират класификацията.
Архитектура с две методологии
Helena прилага две независими методологии за класификация в един и същ анализ: ACMG/AMP 2015 (Richards) за нуклеарни варианти и ClinGen MMDWG 2020 (McCormick) за варианти в мтДНК. Всеки вариант носи изричен етикет за произход на методологията в изхода си, така че генетиците знаят коя интерпретативна методология е произвела класификацията.
Анотация срещу референтни данни за мтДНК
Вариантите в мтДНК се анотират срещу подбран митохондриален референтен набор: твърдения от ClinVar за мтДНК, популационни честоти от gnomAD v3.1 mtDNA с разпределение на хетероплазмия, оценки за варианти с променен смисъл (missense) от APOGEE 2, тРНК оценки от MitoTIP и PON-mt-tRNA, анотации от mt-Phylotree за хаплогрупно-специфични варианти и Ensembl координати на гени в мтДНК с биотип.
Оценка по критериите MMDWG
Единадесет автоматизирани критерия се оценяват за всеки вариант съгласно McCormick 2020: PVS1, PS1, PM2_Supporting, PM4, PM5_Moderate, PM5_Supporting, PP3, BA1, BS1, BP2_Supporting, BP4, BP7. Степените на сила следват конвенциите на ClinGen mtDNA VCEP v1.0.0. Суфикси за ниво на сила се появяват при критерии, приложени с нестандартна ACMG сила.
Интегриране на доказателства от ръчна оценка
Десет критерия за ръчна оценка (PS2, PS3, PS4, PM6, PP1, PP4, BS2, BS3, BS4, BP5) приемат данни, подадени от генетика през интерфейс за оценка с одитна следа и изрични степени на сила (Very Strong, Strong, Moderate, Supporting). Подадената оценка участва в същата оценка по правилата за комбиниране, както автоматизираните критерии.
Правила за комбиниране и приоритет на класификацията
Правилата за комбиниране на Richards 2015 (осемнадесет правила, запазени непроменени съгласно McCormick Раздел 5.2) определят крайната пет-нивова класификация (P, LP, VUS, LB, B). BA1 действа като самостоятелен доброкачествен критерий с най-висок приоритет. Твърдения от ClinVar P/LP/B/LB с две или повече звезди за качество на прегледа осигуряват приоритетна класификация (специфичен за мтДНК по-строг праг съгласно McCormick Раздел 5.1). Противоречиви патогенни и доброкачествени доказателства със сила Moderate или по-висока произвеждат VUS.
Записване и одитна следа
Класификацията, списъкът на критериите със степените на сила, произходът на методологията (mmdwg_2020), версията на MMDWG модула и стойността на достоверност се записват заедно с варианта. Категоризирани пояснителни бележки документират всяко нестандартно решение (дисквалификация на PP1, консервативна оценка на BA1 при несигурна хаплогрупа, принос от ръчна оценка) за одит от генетика.
Отличителни характеристики на Helena
Спецификацията ClinGen MMDWG 2020 е стандартът. Изборите по-долу описват как Helena адресира интерпретативни предизвикателства, които спецификацията поставя, но не предписва конкретна имплементация. Всяка отличителна характеристика е описана на концептуално ниво; конкретната имплементация е част от платформата Helena.
Персонализиран BA1 чрез хаплогрупна принадлежност на пациента
McCormick 2020 Раздел 5.2.10 изисква BA1 да се задейства, когато вариантът надхвърля 1% честота на алел или когато вариантът е характерен за хаплогрупата на пациента. Обикновена проверка дали вариантът определя която и да е хаплогрупа е недостатъчна, защото клиничната интерпретация зависи от това дали пациентът действително носи тази хаплогрупа. Helena извежда хаплогрупата на пациента от VCF файла и оценява всеки кандидат-вариант срещу клона на хаплогрупата на пациента (а не срещу глобалната популация). Когато извеждането на хаплогрупата е несигурно, Helena се връща към консервативна оценка, която прилага BA1 само за пътя с висока честота, като запазва чувствителността за редки варианти. Пример: m.3394T>C е определящ за клон M9a, но патогенен в клон B4c (Ji 2012 PMID:22577229; Kang 2016 PMID:27220472). Същият вариант коректно получава BA1 при пациент M9a и остава кандидат за патогенен при пациент B4c.
Класификация, съобразена с NUMT, с маркери за видимост
Сегментите на нуклеарна митохондриална ДНК (NUMT) са участъци от последователности, подобни на мтДНК, интегрирани в нуклеарния геном (Calabrese 2017 PMID:24723423). Варианти, припокриващи известни NUMT региони, могат да произведат фалшиво-положителни мтДНК варианти, когато характеристиките на дълбочина и покритие на секвенирането предполагат нуклеарен произход. Helena поддържа подбран каталог на публикувани NUMT региони и извежда маркери за припокриване с NUMT и аномалии в дълбочината за генетика. Маркерите са препоръчителни, а не блокиращи: класификацията продължава съгласно MMDWG, а генетикът прави крайната преценка за псевдоген, на основата на предоставените маркери.
Архитектура с две методологии и изричен произход
Митохондриалната и нуклеарната генетика се различават по унаследяване, мутационна скорост, хетероплазмия и интерпретация на честотата на алели. McCormick 2020 изрично модифицира, понижава или изключва ACMG критерии за мтДНК. Helena държи двете методологии напълно разделени: нуклеарните варианти се класифицират съгласно ACMG/AMP 2015, мтДНК вариантите - съгласно ClinGen MMDWG 2020, и всеки вариант в изхода носи изричен етикет за приложената методология, така че генетикът винаги знае коя от двете е произвела резултата. Няма скрита употреба на нуклеарните прагове за мтДНК варианти и няма смесване на набори от критерии.
Процес за ръчна оценка със степени на сила
Десет от двадесет и петте ACMG критерии изискват доказателства, неизводими само от VCF и референтни данни: родителска сегрегация (PS2, PM6, PP1, BS4), функционални проучвания (PS3, BS3), статистики случай-контрол (PS4), фенотипна специфичност (PP4), наблюдение в здрав индивид (BS2) и контекст за алтернативна диагноза (BP5). Helena излага тези критерии през интерфейс за ръчна оценка с одитна следа и изрични степени на сила съгласно ClinGen mtDNA VCEP v1.0.0: четири степени (Very Strong / Strong / Moderate / Supporting) за PS2 и PM6 съгласно McCormick Раздели 5.2.3 и 5.2.6; две степени (Strong / Supporting) за BS2 съгласно McCormick Раздел 5.2.10; определени от спецификацията степени за PS3, PS4, PM6, PP1, PP4, BS3, BS4 и BP5. Силата на PS4 и PP1 може също така да се извежда автоматично от пробандски броеве и статистики за хаплогрупна разнородност, когато са налични.
Подробна одитна следа с категоризирани бележки
Всяко нестандартно решение по класификация генерира одитна бележка, прикрепена към записа на варианта: премахване на NMD-разклонението на PVS1 съгласно Abou Tayoun (само пътят за иРНК), консервативна оценка на BA1 при несигурна хаплогрупа, PM5_Supporting за тРНК / рРНК съгласно McCormick Раздел 5.2.2, принос от ръчна оценка от посочения генетик, проверка за приоритет на ClinVar класификацията и други. Одитните бележки са категоризирани, така че генетиците могат бързо да преглеждат обосновката на всяка класификация и одитори по акредитация могат да реконструират пътя на решението за всеки вариант.
Референтни бази
Всички референтни данни за мтДНК се съхраняват локално на инфраструктура в ЕС. По време на обработка не се изпращат данни за варианти към външни услуги. Версиите на базите са фиксирани за всяко внедряване и са документирани тук.
mt_clinvar_variants
Твърдения за клинично значение от ClinVar, филтрирани до chrM. Разпределение: 78 P (патогенни), 109 LP (вероятно патогенни), 1 269 VUS, 612 LB (вероятно доброкачествени), 1 017 B (доброкачествени), 34 без предоставена класификация, 3 други. Звезди за преглед: 119 без звезда, 2 452 с една звезда, 238 с две звезди, 313 с три звезди. Helena запазва както каноничния код за клинично значение (P, LP, VUS, LB, B), така и оригиналния низ от ClinVar за проследимост на одита.
Използва се от: PS1 (същата аминокиселинна промяна като при известен патогенен вариант, само пътят за иРНК), PM5_Moderate (различен вариант с променен смисъл на същия остатък, иРНК), PM5_Supporting (същата нуклеотидна позиция, тРНК / рРНК, McCormick Раздел 5.2.2), BP2_Supporting (друг вариант в мтДНК в същата сесия е ClinVar P/LP) и проверката за приоритет на ClinVar класификацията при две или повече звезди за качество на прегледа (по-строг от нуклеарния праг от една звезда съгласно McCormick Раздел 5.1).
Източник: NCBI ClinVar
mt_population_frequencies
Честоти на алели за хомоплазмични и хетероплазмични варианти на ниво вариант, максимална хетероплазмия на индивид, маркер за хаплогрупна специфичност, маркер за честа ниска хетероплазмия, необработена оценка от MitoTIP, MitoTIP клас на тРНК предсказание, PON-mt-tRNA клас на предсказание и PON-mt-tRNA вероятност за патогенност. Разпределение: 124 варианта с честота на алел > 5%, 429 варианта > 1%, 4 299 хаплогрупно-специфични варианта, 374 варианта с честа ниска хетероплазмия.
Използва се от: BA1 (честота на алел > 1% самостоятелен доброкачествен или характерен за хаплогрупата на пациента, McCormick Раздел 5.2.10), BS1 (честота на алел 0,5–0,99%, силно доброкачествено доказателство, McCormick Раздел 5.2.5), PM2_Supporting (честота на алел < 0,00002, отсъстващ от контролни популации, понижен от Moderate съгласно McCormick Раздел 5.2.5), PP3 тРНК път (MitoTIP > 50-ти персентил, комбинирано с PON-mt-tRNA > 0,5), BP4 тРНК път (огледално).
Източник: gnomAD
mt_apogee2_scores
Числови оценки за патогенност от APOGEE 2 за всяка възможна замяна с променен смисъл (missense) в мтДНК през 13-те белтък-кодиращи гена. Диапазон на оценките 0,0–0,981 със свързана вероятност и клас. Спомагателни предикторни оценки (AlphaMissense, MitoClass1, PolyPhen2, SIFT, FATHMM, CADD) и статус на заболяване в MitoMap са запазени за клинична справка. APOGEE 1 е запазен като колона за обратна съвместимост, но не се използва от действащата PP3 / BP4 логика за иРНК.
Използва се от: PP3 път за иРНК (APOGEE 2 > 0,5 задейства подкрепящо патогенно доказателство съгласно McCormick Фигура 3), BP4 път за иРНК (APOGEE 2 <= 0,5 задейства подкрепящо доброкачествено доказателство, огледално).
Източник: MitImpact
mt_gene_coordinates
Координатни граници и класификация по биотип за всеки ген в мтДНК. Разпределение по биотип: 22 Mt_tRNA, 13 белтък-кодиращи, 2 Mt_rRNA (MT-RNR1, MT-RNR2). Информацията за ДНК веригата (strand) се запазва, за да се обработват коректно гените, транскрибирани от леката верига (MT-TQ, MT-TA, MT-TN, MT-TC, MT-TY, MT-TS1, MT-ND6, MT-TE, MT-TP).
Използва се от: Насочване по клас на ген за критерии със специфично за биотипа поведение: PVS1, PS1, PM4, PM5_Moderate, PM5_Supporting, PP3, BP4 и BP7 имат логика, съобразена с биотипа съгласно McCormick 2020.
Източник: Ensembl
mt_haplogroups
Филогенетично дърво на матерински хаплогрупи с варианти, съпоставени към всеки клон, връзки към родителски хаплогрупи, маркери за обратна мутация и инсерция и анотации за модификатори на варианти. Предоставя структурата от данни, необходима за оценка дали кандидат-вариант е характерен за който и да е предшественик по линията на хаплогрупата на пациента.
Използва се от: Адаптиран за пациента BA1 (вариантът е характерен за хаплогрупата по матерска линия на пациента). Когато извеждането на хаплогрупата не е налично за проба, Helena се връща към консервативна оценка на BA1, която не прилага прекомерно самостоятелния доброкачествен критерий.
Източник: PhyloTree
mt_helix_curated
Резервирана таблица за клинични замествания на твърдения от ClinVar в Helena. Всеки запис записва каноничната Helena класификация, обосновката и маркер, указващ дали записът замества противоречив запис в ClinVar. Таблицата е празна в публичния референтен набор и се попълва само от посочени генетици през интерфейс за ръчна оценка с одитна следа.
Използва се от: Слой за клинично заместване, прилаган преди проверката за приоритет на ClinVar класификацията.
Източник: Helena Bioinformatics
nuclear_numt_known_regions
Каталог на региони на нуклеарна митохондриална ДНК (NUMT) с хромозома, начало, край, дължина и посочване на източника. Използва се за маркиране на кандидати за псевдогенни варианти при разпределяне по хромозома.
Използва се от: Маркери за видимост на NUMT, изведени за одит от генетика. Маркерите за припокриване с NUMT и аномалии в дълбочината са препоръчителни; класификацията продължава съгласно MMDWG, а генетикът прави крайната преценка за псевдоген.
Източник: Published NUMT catalogs
MMDWG класификация
Класификацията на варианти следва спецификацията на ClinGen Mitochondrial Disease Working Group 2020 с двадесет и пет систематично оценявани критерия за доказателства. Единадесет критерия са напълно автоматизирани; десет изискват ръчна оценка от генетика; седем са изключени съгласно McCormick Раздел 5.3.
Ред на приоритет при класификация
Класификацията следва строг ред на приоритет. Правилата се проверяват отгоре надолу и първото, което съвпадне, определя крайния резултат:
BA1 - самостоятелен критерий
Честота на алел над 1% хомоплазмична или вариантът е характерен за хаплогрупата на пациента (адаптиран за пациента BA1 в Helena). BA1 е единственият самостоятелен критерий в методологията MMDWG и не може да бъде заменен от никакво друго доказателство, включително твърдения от ClinVar.
Противоречиви доказателства
Когато за един вариант едновременно са налице патогенни доказателства със сила Moderate или по-висока (PVS, PS или PM) и силни доброкачествени доказателства (BS), резултатът е VUS. Това е целенасочено консервативен подход - клиничната безопасност е над всичко.
Приоритет на ClinVar класификацията
Класификация P/LP/B/LB от ClinVar се прилага само когато не съществуват противоречиви изчислителни доказателства. Изисква две или повече звезди за качество на прегледа (по-строг от нуклеарния праг от една звезда съгласно McCormick Раздел 5.1). VUS от ClinVar не замества изчислителната класификация.
Правила за комбиниране
Осемнадесетте правила за комбиниране на Richards 2015 (Таблица 5) се оценяват срещу критериите, задействани за варианта. Правилата са запазени непроменени за мтДНК съгласно McCormick Раздел 5.2.
По подразбиране
Ако нито едно от горните правила не съвпадне, вариантът получава VUS (с неясно значение).
Изход от класификацията
Всеки вариант получава една от петте стандартни класификации, списък на всички задействани критерии със степени на сила (например „PVS1, PM2_Supporting, PP3"), означение за приложената методология (mmdwg_2020), версията на MMDWG модула и числова стойност на достоверност:
Патогенен
Вероятно патогенен
VUS
Вероятно доброкачествен
Доброкачествен
Автоматизирани критерии (11 от 25)
Тези критерии се оценяват автоматично за всеки вариант в мтДНК. Условията и праговете следват спецификацията McCormick 2020. За всеки критерий са посочени референтните източници, от които зависи, и всякакво специфично за биотипа поведение.
Нулев вариант в ген, в който загубата на функция е известен механизъм на болест
Условия:
Прилага се само за белтък-кодиращи (иРНК) гени в мтДНК.
Скъсяваща последица: stop_gained или frameshift.
Модулация на силата съгласно Abou Tayoun 2018 (PMID:30192042) дърво за решения, адаптирано за мтДНК: McCormick 2020 запазва подхода на Abou Tayoun с изричното премахване на NMD клона (мтДНК иРНК не са обект на каноничен нуклеарен NMD).
Изключения:
тРНК и рРНК гени (PVS1 не е дефиниран съгласно McCormick за тези биотипове).
Варианти без загуба на стоп-кодон (stop-retained) и варианти със загуба на стоп-кодон (stop-lost).
Неканонични варианти на сплайсинг (мтДНК не подлежи на нуклеарен сплайсинг).
Референтни данни: Ensembl координати на гени в мтДНК (насочване по биотип), VEP (последица)
Съгласно McCormick Раздел 5.2.1 нуклеарното NMD разклонение на дървото за решения на Abou Tayoun е премахнат за мтДНК. Скъсяващите варианти в мтДНК се оценяват само за ефекта си върху зрелия белтък.
Същата аминокиселинна промяна като при установен патогенен вариант
Условия:
Прилага се само за белтък-кодиращи (иРНК) гени в мтДНК.
ClinVar P (патогенен) или LP (вероятно патогенен) с две или повече звезди за качество на прегледа на същия белтъчен остатък със същата аминокиселинна замяна.
Изключения:
тРНК и рРНК гени (PS1 не е приложим за некодиращи биотипове).
Референтни данни: mt_clinvar_variants
McCormick Раздел 5.2.1 запазва PS1 със стандартното определение за съвпадение на аминокиселинно ниво за иРНК гени. Прагът от две звезди за качество на прегледа е по-строг от нуклеарния праг и съответства на изискването за повишени доказателства, посочено в McCormick Раздел 5.1.
Отсъстващ в популационни бази
Условия:
Хомоплазмична честота на алел от gnomAD v3.1 mtDNA под прага за отсъствие в контролни популации (по подразбиране 0,00002) или вариантът е изцяло отсъстващ от gnomAD.
Референтни данни: mt_population_frequencies
McCormick Раздел 5.2.5 изрично понижава PM2 от Moderate (нуклеарна стандартна стойност) до Supporting за мтДНК, отразявайки намалената статистическа мощност на аргументи на популационна честота при изключително ниски честоти в мтДНК.
Промяна на дължината на белтъка в нерепетитивен регион
Условия:
Прилага се само за белтък-кодиращи (иРНК) гени в мтДНК.
Инсерция или делеция със запазена рамка, която променя дължината на белтъка в регион, който не е анотиран като репетитивен или с ниска сложност.
Изключения:
тРНК и рРНК гени (PM4 не е приложим, промените в дължината се оценяват чрез PM5_Supporting и PP3 тРНК път).
Референтни данни: Ensembl координати на гени в мтДНК (насочване по биотип), VEP (последица)
Различна промяна с променен смисъл (missense) на остатък с установен патогенен вариант с променен смисъл
Условия:
Прилага се само за белтък-кодиращи (иРНК) гени в мтДНК.
ClinVar P (патогенен) или LP (вероятно патогенен) с две или повече звезди за качество на прегледа на същия белтъчен остатък, но с различна аминокиселинна замяна.
Изключения:
тРНК и рРНК гени (обработват се от PM5_Supporting съгласно McCormick Раздел 5.2.2).
Референтни данни: mt_clinvar_variants
Различна нуклеотидна промяна на позиция с установен патогенен вариант в тРНК / рРНК
Условия:
Прилага се само за тРНК и рРНК гени в мтДНК.
ClinVar P (патогенен) или LP (вероятно патогенен) с две или повече звезди за качество на прегледа на същата нуклеотидна позиция, но с различен алтернативен алел.
Изключения:
Белтък-кодиращи (иРНК) гени (покрити от PM5_Moderate на ниво остатък).
Референтни данни: mt_clinvar_variants, Ensembl координати на гени в мтДНК (насочване по биотип)
McCormick Раздел 5.2.2 въвежда PM5_Supporting специално за тРНК и рРНК биотипове, при които съпоставянето на аминокиселинно ниво не е приложимо. Съпоставяне по принципа „същ нуклеотид - различен алел" на ниво Supporting.
Изчислителни доказателства подкрепят увреждащ ефект
Условия:
път за иРНК: оценка на APOGEE 2 над патогенния праг (по подразбиране 0,5). Съгласно McCormick Фигура 3 APOGEE е препоръчителният биоинформатичен инструмент за варианти с променен смисъл (missense) в мтДНК.
тРНК път: MitoTIP оценка над 50-ти персентил, комбинирана с вероятност за патогенност от PON-mt-tRNA над 0,5.
рРНК път: не се оценява. McCormick 2020 не препоръчва калибриран биоинформатичен предиктор за рРНК, така че PP3 не се прилага за двата рРНК гена.
Изключения:
Биотип рРНК (PP3 не се прилага съгласно McCormick).
PVS1 е активен за същия вариант (без двойно отчитане съгласно ClinGen SVI 2023).
Референтни данни: mt_apogee2_scores, mt_population_frequencies (MitoTIP, PON-mt-tRNA), Ensembl координати на гени в мтДНК (насочване по биотип)
Честота на алел, съвместима със самостоятелен доброкачествен
Условия:
Хомоплазмична честота на алел от gnomAD v3.1 mtDNA над 1% (McCormick Раздел 5.2.10) ИЛИ вариантът е характерен за хаплогрупата на пациента (адаптиран за пациента BA1 в Helena).
Референтни данни: mt_population_frequencies, mt_haplogroups
McCormick Раздел 5.2.10 понижава прага на BA1 от нуклеарните 5% до 1% за мтДНК. Helena оценява клаузата за хаплогрупна специфичност срещу клона на пациента (а не срещу който и да е клон глобално), така че варианти, характерни за несвързан хаплогрупен клон, не получават BA1 при пациента. Когато извеждането на хаплогрупата е несигурно, Helena се връща към консервативен път, който прилага BA1 само за пътя с висока честота над 1%.
Честота на алел над очакваната за заболяването
Условия:
Хомоплазмична честота на алел от gnomAD v3.1 mtDNA между 0,5% и 0,99%.
Изключения:
Вариантът отговаря на BA1 (BA1 има предимство като самостоятелен доброкачествен).
Референтни данни: mt_population_frequencies
McCormick Раздел 5.2.5 определя прага от 0,5% за силно доброкачествено доказателство при мтДНК, отделен от прага на BA1 от 1%. Двете заедно заместват нуклеарната двойка 5% / 1%.
Наблюдаван заедно с установен патогенен мтДНК вариант в същия индивид
Условия:
Друг вариант в същата сесия на пациента е ClinVar P (патогенен) или LP (вероятно патогенен) в мтДНК с две или повече звезди за качество на прегледа.
Референтни данни: mt_clinvar_variants
Специфично за мтДНК преформулиране на BP2: при липса на нуклеарна транс/цис конфигурация, наличието на установен патогенен мтДНК вариант в същия индивид осигурява подкрепящо доброкачествено доказателство за допълнителен кандидат-вариант в същия митохондриален геном.
Изчислителни доказателства предполагат липса на ефект
Условия:
път за иРНК: оценка на APOGEE 2 под доброкачествения праг (по подразбиране 0,5). Огледално обратен на PP3 път за иРНК.
тРНК път: MitoTIP оценка на или под 50-ти персентил, комбинирана с вероятност за патогенност от PON-mt-tRNA на или под 0,5.
Изключения:
Биотип рРНК (BP4 не се прилага съгласно McCormick, без калибриран рРНК предиктор).
PVS1 е активен за същия вариант.
Референтни данни: mt_apogee2_scores, mt_population_frequencies, Ensembl координати на гени в мтДНК (насочване по биотип)
Синонимен вариант без предсказан ефект
Условия:
Прилага се само за белтък-кодиращи (иРНК) гени в мтДНК.
Синонимна последица (без аминокиселинна промяна).
Без предсказан ефект върху сплайсинга (мтДНК не подлежи на нуклеарен сплайсинг; клаузата за сплайсинг от нуклеарната ACMG версия не се оценява).
Изключения:
тРНК и рРНК гени (понятието за синонимен вариант не е приложимо).
Референтни данни: Ensembl координати на гени в мтДНК (насочване по биотип), VEP (последица)
Критерии за ръчна оценка (10 от 25)
Тези критерии изискват доказателства, неизводими само от VCF и референтни данни: матерска сегрегация, функционални анализи, статистики случай-контрол, фенотипна специфичност, наблюдение в здрав индивид и контекст за алтернативна диагноза. Прегледащите генетици подават доказателства от ръчна оценка през интерфейс за оценка на Helena с одитна следа и изрични степени на сила съгласно ClinGen mtDNA VCEP v1.0.0.
Вариант de novo с потвърдено майчинство
мтДНК се унаследява по майчина линия. Силата на PS2 се определя от броя на независимите майчински-потвърдени de novo наблюдения и доказателствата за сегрегация в подкрепа на произход de novo. Четиристепенната скала се избира от генетика през интерфейс за ръчна оценка.
Функционални проучвания показват увреждащ ефект
McCormick ограничава PS3 до Supporting сила за мтДНК до бъдеща калибрация на митохондриалните функционални анализи. Прегледащите генетици подават публикувани функционални доказателства през интерфейс за ръчна оценка и цитират подкрепящ PMID.
Повишена честота при засегнати в сравнение с контроли
Силата на PS4 се избира от генетика или, когато статистики за пробандски броеве и хаплогрупна разнородност са налични в метаданните на сесията, се извежда автоматично от интерфейса за ръчна оценка. Ръчно въведени стойности винаги заместват автоматичните извеждания и се записват с източника на извеждане за проследимост на одита.
Предполагаемо de novo без потвърждение на майчинство
Аналог на PS2, когато потвърждението на майчинство не е налично. Четиристепенната скала съответства на PS2.
Косегрегация с болестта при майчински роднини
McCormick Раздел 5.2.7 определя дисквалификатор „хомоплазмичен във всички майчински членове“: ако вариантът е хомоплазмичен във всеки майчински роднина, независимо от фенотипа, PP1 не може да се задейства, защото косегрегацията не е информативна. Helena прилага този дисквалификатор автоматично, когато въведените броеве на майчински членове показват равномерна хомоплазмия. Одитната следа записва дисквалификацията, когато се прилага.
Фенотипът на пациента е силно специфичен за митохондриално разстройство
Прегледащият генетик потвърждава фенотипната специфичност през интерфейс за ръчна оценка. Специфични за мтДНК фенотипни модели (Леберова наследствена оптична невропатия, MELAS, MERRF, NARP, синдром на Leigh) предоставят типичната доказателствена база.
Наблюдаван при здрав майчински роднина
McCormick пропуска степените Very Strong и Moderate от BS2 за мтДНК. Двустепенната скала се избира от генетика.
Функционални проучвания не показват увреждащ ефект
Силата е ограничена до Supporting съгласно McCormick. Прегледащите генетици подават публикувани доброкачествени функционални доказателства с подкрепящ PMID.
Липса на сегрегация при засегнати майчински роднини
Силно доброкачествено доказателство, когато засегнати майчински роднини не носят варианта. Избира се от генетика през интерфейс за ръчна оценка.
Вариант, открит при случай с алтернативна молекулярна основа
Прегледащият генетик потвърждава алтернативната диагноза през интерфейс за ръчна оценка, като алтернативната диагноза се записва в одитната следа.
Изключени критерии (7 от 25)
McCormick 2020 Раздел 5.3 изключва седем нуклеарни ACMG критерия от интерпретация на мтДНК, защото техните основни предположения не важат за митохондриалния геном. Helena не прилага никой от тези критерии към варианти в мтДНК.
Доказателства за функционален домейн с повишена честота на мутации за варианти в мтДНК тРНК се улавят чрез MitoTIP (PP3 тРНК път), който сам по себе си е изчислителен инструмент, съобразен с домейна. Добавянето на PM1 отгоре би отчело двойно същия биологичен аргумент. McCormick Раздел 5.3 изключва PM1, за да предотврати това двойно отчитане.
PM3 (в транс-конфигурация с патогенен вариант при рецесивни нарушения) предполага наследяване от двамата родители и автозомно-рецесивен механизъм. мтДНК се унаследява по майчина линия и няма автозомно-рецесивен аналог, така че PM3 е биологично неприложим.
PP2 изисква вариантите с променен смисъл (missense) да са общ механизъм на болест в ген с количествено определена нетолерантност. мтДНК показва висока вариативност на последователността сред хаплотипите, което прави ген-нивовите статистики за нетолерантност към варианти с променен смисъл неинформативни. McCormick Раздел 5.3 изключва PP2.
Работната група на ClinGen за интерпретация на секвенционни варианти (Biesecker 2018, PMID:29543229) препоръча оттегляне на PP5 като излишен критерий, обхванат от PS1, PM5 и проверката за приоритет на ClinVar класификацията. McCormick приема тази препоръка за мтДНК.
BP1 се прилага за гени, при които предимно скъсяващи варианти причиняват болест, и се използва срещу патогенност на варианти с променен смисъл (missense). Каталогът на болестите в мтДНК включва значително натоварване от патогенни варианти с променен смисъл в белтък-кодиращите гени, така че предпоставката на BP1 не важи.
BP3 покрива вмъквания и делеции със запазена рамка в репетитивни или с ниска сложност нуклеарни региони (от типа на хипервариабилните региони). Хипервариабилните региони (D-loop) в мтДНК са клинично изключени от интерпретация изцяло, така че BP3 не е необходим като отделен подкрепящ доброкачествен критерий.
Същата обосновка за премахване от ClinGen SVI както при PP5: обхванат от проверката за приоритет на ClinVar класификацията при две или повече звезди за качество на прегледа и не е необходим като отделен подкрепящ доброкачествен критерий.
Изчислителни предиктори (PP3 / BP4)
PP3 и BP4 се насочват по биотип на гена. Белтък-кодиращите гени в мтДНК използват APOGEE 2 (Bianco 2023). тРНК гените в мтДНК използват комбинирана оценка MitoTIP плюс PON-mt-tRNA съгласно McCormick Фигура 3. рРНК гените в мтДНК нямат калибриран предиктор и PP3 / BP4 не се прилагат за двата рРНК гена.
APOGEE 2 (път за иРНК)
APOGEE 2 (Bianco 2023, PMID:PMC10439926) е модел с многослойно машинно обучение, калибриран за предсказване на патогенност на варианти с променен смисъл (missense) в мтДНК. Helena използва предварително изчислени оценки на APOGEE 2 от дистрибуцията MitImpact 3.1.3, покриващи всички 24 190 възможни замени с променен смисъл в 13-те белтък-кодиращи гена. Оценка над патогенния праг (по подразбиране 0,5) задейства PP3 Supporting; оценка на или под прага задейства BP4 Supporting. APOGEE 1 е запазен като колона за обратна съвместимост, но не се използва от действащата PP3 / BP4 логика.
MitoTIP + PON-mt-tRNA (тРНК път)
McCormick Фигура 3 определя комбинирана оценка: MitoTIP (Sonney 2017, PMID:28809476) и PON-mt-tRNA (Niroula и Vihinen 2019, PMID:31504522) за варианти в тРНК. PP3 се задейства, когато MitoTIP надхвърля 50-ти персентил и вероятността за патогенност от PON-mt-tRNA надхвърля 0,5. BP4 е огледалният обратен случай. И двата инструмента са калибрирани специфично за варианти в мтДНК тРНК и осигуряват допълнителни оценки, съобразени с домейна и основани на вероятност.
рРНК път: не се оценява
McCormick 2020 не препоръчва калибриран биоинформатичен предиктор за двата рРНК гена в мтДНК (MT-RNR1, MT-RNR2). PP3 и BP4 не се прилагат за варианти с биотип рРНК. Оценката на патогенност за варианти в рРНК се основава на PVS1 (където е приложимо), PS1, PM2_Supporting, BA1, BS1, критериите за ръчна оценка с одитна следа и проверката за приоритет на ClinVar класификацията.
Правила за комбиниране
Осемнадесетте правила за комбиниране на доказателства от Richards 2015 (Таблица 5) са запазени непроменени за мтДНК съгласно McCormick Раздел 5.2. Степените на сила от McCormick (PM2_Supporting, PM5_Supporting, BS2 две степени, PS3 / BS3 ограничени до Supporting) се подават директно в същата оценка по правилата за комбиниране.
Патогенен (8 правила)
Вероятно патогенен (6 правила)
Доброкачествен (2 правила)
Вероятно доброкачествен (2 правила)
Митохондриален геном
Човешкият митохондриален геном с 16 569 бази кодира 37 гена: 13 белтък-кодиращи гена (субединици на OXPHOS комплекси I, III, IV, V - окислително фосфорилиране), 22 гена за трансферна РНК (по един за аминокиселина плюс два за левцин и серин) и 2 гена за рибозомна РНК (12S и 16S). Биотипът на гена определя пътя на критериите съгласно MMDWG.
| Ген | Биотип | Начало | Край | Верига |
|---|---|---|---|---|
| MT-TF | Mt_tRNA | 577 | 647 | + |
| MT-RNR1 | Mt_rRNA | 648 | 1,601 | + |
| MT-TV | Mt_tRNA | 1,602 | 1,670 | + |
| MT-RNR2 | Mt_rRNA | 1,671 | 3,229 | + |
| MT-TL1 | Mt_tRNA | 3,230 | 3,304 | + |
| MT-ND1 | protein_coding | 3,307 | 4,262 | + |
| MT-TI | Mt_tRNA | 4,263 | 4,331 | + |
| MT-TQ | Mt_tRNA | 4,329 | 4,400 | - |
| MT-TM | Mt_tRNA | 4,402 | 4,469 | + |
| MT-ND2 | protein_coding | 4,470 | 5,511 | + |
| MT-TW | Mt_tRNA | 5,512 | 5,579 | + |
| MT-TA | Mt_tRNA | 5,587 | 5,655 | - |
| MT-TN | Mt_tRNA | 5,657 | 5,729 | - |
| MT-TC | Mt_tRNA | 5,761 | 5,826 | - |
| MT-TY | Mt_tRNA | 5,826 | 5,891 | - |
| MT-CO1 | protein_coding | 5,904 | 7,445 | + |
| MT-TS1 | Mt_tRNA | 7,446 | 7,514 | - |
| MT-TD | Mt_tRNA | 7,518 | 7,585 | + |
| MT-CO2 | protein_coding | 7,586 | 8,269 | + |
| MT-TK | Mt_tRNA | 8,295 | 8,364 | + |
| MT-ATP8 | protein_coding | 8,366 | 8,572 | + |
| MT-ATP6 | protein_coding | 8,527 | 9,207 | + |
| MT-CO3 | protein_coding | 9,207 | 9,990 | + |
| MT-TG | Mt_tRNA | 9,991 | 10,058 | + |
| MT-ND3 | protein_coding | 10,059 | 10,404 | + |
| MT-TR | Mt_tRNA | 10,405 | 10,469 | + |
| MT-ND4L | protein_coding | 10,470 | 10,766 | + |
| MT-ND4 | protein_coding | 10,760 | 12,137 | + |
| MT-TH | Mt_tRNA | 12,138 | 12,206 | + |
| MT-TS2 | Mt_tRNA | 12,207 | 12,265 | + |
| MT-TL2 | Mt_tRNA | 12,266 | 12,336 | + |
| MT-ND5 | protein_coding | 12,337 | 14,148 | + |
| MT-ND6 | protein_coding | 14,149 | 14,673 | - |
| MT-TE | Mt_tRNA | 14,674 | 14,742 | - |
| MT-CYB | protein_coding | 14,747 | 15,887 | + |
| MT-TT | Mt_tRNA | 15,888 | 15,953 | + |
| MT-TP | Mt_tRNA | 15,956 | 16,023 | - |
Координатите са спрямо GRCh38 chrM (NC_012920.1, ревизираната Cambridge Reference Sequence). Източник: Ensembl анотация за мтДНК.
Ограничения и уговорки
Helena е инструмент за подкрепа на клинично решение, а не диагностично устройство. Всяка класификация изисква преглед и потвърждение от квалифициран клиничен генетик.
Десет от двадесет и петте MMDWG критерия изискват доказателства, неизводими само от VCF и референтни данни (PS2, PS3, PS4, PM6, PP1, PP4, BS2, BS3, BS4, BP5). Тези критерии се въвеждат от генетика през интерфейс за ръчна оценка с одитна следа и изрични степени на сила съгласно ClinGen mtDNA VCEP v1.0.0.
Интерпретацията на хетероплазмия е специфична за пациента. Хомоплазмични, хетероплазмични и тъканно-ограничени модели на хетероплазмия носят различни клинични значения. Helena показва максималната хетероплазмия и разпределението на хетероплазмия по индивид за всеки вариант, но клиничната интерпретация на нивата на хетероплазмия остава преценка на генетика.
Извеждането на хаплогрупата на пациента зависи от входния VCF файл. Когато информативни за хаплогрупата варианти липсват или са недостатъчни, Helena се връща към консервативна оценка на BA1, вместо да отгатва хаплогрупата. Одитната следа записва резервния подход, когато се прилага.
Сегментите на нуклеарна митохондриална ДНК (NUMT) могат да произведат фалшиво-положителни мтДНК варианти. Helena маркира сигнали за припокриване с NUMT и аномалии в дълбочината за одит от генетика, но не блокира класификацията. Прегледащият генетик прави крайната преценка за псевдоген.
Данните за популационни честоти от gnomAD v3.1 mtDNA може да не представят достатъчно добре определени родови популации. Праговете на честотата на алел трябва да се интерпретират в контекста на родовата принадлежност на пациента.
Твърденията за мтДНК в ClinVar варират по качество и актуалност. Прагът от две или повече звезди за качество на прегледа (по-строг от нуклеарния праг съгласно McCormick Раздел 5.1) намалява влиянието на непрегледани твърдения от единичен подател, но не може да го елиминира изцяло.
PS3 и BS3 са ограничени до Supporting сила съгласно McCormick 2020 до бъдеща калибрация на митохондриалните функционални анализи. Функционални доказателства, които биха отговаряли на Strong или Moderate сила съгласно нуклеарната ACMG методология, в момента са с понижена степен.
Извеждането на хаплогрупа чрез Haplogrep3 и външната анотация чрез HmtVAR са резервирани за бъдеща фаза на внедряване. Работната среда в момента разчита на филогенетичното дърво на матерински хаплогрупи (PhyloTree FU1a) и подбран референтен набор, описан по-горе.
Резултатите винаги трябва да се интерпретират в контекста на клиничното представяне на пациента, фамилната история, митохондриалните функционални проучвания, ако са налични, и друга клинична информация.
История на версиите
Всяка промяна в методологията е версионирана и документирана. Версията на MMDWG модула е независима от версията на основния класификационен модул.
Въвеждане в работна среда на класификатора ClinGen MMDWG 2020 за мтДНК (McCormick 2020 PMID:33058415). Единадесет автоматизирани критерия, десет критерия за ръчна оценка с одитна следа и изрични степени на сила съгласно ClinGen mtDNA VCEP v1.0.0, седем изключени съгласно McCormick Раздел 5.3.
Архитектура с две методологии: нуклеарна ACMG/AMP 2015 (Richards) и мтДНК MMDWG 2020 (McCormick) работят като независими класификационни модули с изричен етикет за произход на методологията на всеки вариант в изхода.
Адаптиран за пациента BA1: клаузата за хаплогрупна специфичност от McCormick Раздел 5.2.10 се оценява срещу клона на хаплогрупата на пациента чрез PhyloTree build 17 (FU1a release). Консервативна оценка при несигурно извеждане на хаплогрупата.
Класификация, съобразена с NUMT: подбран каталог на 784 NUMT региона в 23 хромозоми захранва маркери за видимост, изведени за одит от генетика. Класификацията продължава съгласно MMDWG; преценката за псевдоген остава задача на генетика.
Интерфейс за ръчна оценка с одитна следа за десетте критерия за ръчна оценка (PS2, PS3, PS4, PM6, PP1, PP4, BS2, BS3, BS4, BP5) с избор на степен на сила и улавяне на цитат на PMID.
Категоризирани пояснителни бележки: всяко нестандартно решение (премахване на NMD разклонението на PVS1, консервативна оценка на BA1, дисквалификация на PP1, PM5_Supporting за тРНК / рРНК, принос от ръчна оценка) се записва за одит от генетика.
Литература
McCormick EM, Lott MT, Dulik MC, Shen L, Attimonelli M, Vitale O, et al. Specifications of the ACMG/AMP standards and guidelines for mitochondrial DNA variant interpretation.
Human Mutation. 2020;41(12):2028-2057.
PMID: 33058415Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.
Genetics in Medicine. 2015;17(5):405-424.
PMID: 25741868Abou Tayoun AN, Pesaran T, DiStefano MT, Oza A, Rehm HL, Biesecker LG, Harrison SM. Recommendations for interpreting the loss of function PVS1 ACMG/AMP variant criterion.
Human Mutation. 2018;39(11):1517-1524.
PMID: 30192042Bianco SD, Parca L, Petrizzelli F, Biagini T, Giovannetti A, Liorni N, et al. APOGEE 2: multi-layer machine-learning model for the interpretable prediction of mitochondrial missense variants.
Nature Communications. 2023;14:5562.
PMID: PMC10439926Sonney S, Leipzig J, Lott MT, Zhang S, Procaccio V, Wallace DC, Sondheimer N. Predicting the pathogenicity of novel variants in mitochondrial tRNA with MitoTIP.
PLoS Computational Biology. 2017;13(12):e1005867.
PMID: 28809476Niroula A, Vihinen M. PON-mt-tRNA: a multifactorial probability-based method for classification of mitochondrial tRNA variations.
Nucleic Acids Research. 2016;44(5):2020-2027.
PMID: 31504522Schoenherr S, Weissensteiner H, Kronenberg F, Forer L. Haplogrep 3 - phylogenetic analysis and quality control for mitochondrial DNA variants.
Nucleic Acids Research. 2023;51(W1):W263-W268.
PMID: PMC10320189Calabrese FM, Simone D, Attimonelli M. Primates and mouse NumtS in the UCSC Genome Browser.
BMC Bioinformatics. 2012;13(Suppl 4):S15.
PMID: 24723423Ji Y, Liang M, Zhang J, Zhang M, Zhu J, Meng X, et al. Mitochondrial haplotypes may modulate the phenotypic manifestation of the LHON-associated m.11778G>A mutation.
Mitochondrion. 2012;12(5):597-602.
PMID: 22577229Kang X, Wei X, Jiang L, Niu C, Zhang J, Chen S, Meng D. Composition and variation analysis of the 16S rDNA in mitochondrial haplogroups.
Mitochondrion. 2016;30:60-65.
PMID: 27220472Walker LC, Hoya M, Wiggins GAR, Lindy A, Vincent LM, Parsons MT, et al. Using the ACMG/AMP framework to capture evidence related to predicted and observed impact on splicing: Recommendations from the ClinGen SVI Splicing Subgroup.
American Journal of Human Genetics. 2023;110(7):1046-1067.
PMID: 37352859Biesecker LG, Harrison SM; ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group. The ACMG/AMP reputable source criteria for the interpretation of sequence variants.
Genetics in Medicine. 2018;20(12):1687-1688.
PMID: 29543229Имате въпроси относно нашата методология за мтДНК?
Приветстваме технически въпроси от клинични генетици, специалисти по митохондриални болести и ръководители на лаборатории. Прозрачността е в основата на клиничното доверие.